Τεστ μικροβιώματος, 6 κριτήρια που αναδεικνύουν την ποιότητα του αποτελέσματος

Γιατί δύο τεστ μικροβιώματος μπορεί να σου δώσουν αντικρουόμενα αποτελέσματα

Ένα τεστ μικροβιώματος μπορεί να δώσει διαφορετικό αποτέλεσμα σε δύο διαφορετικά εργαστήρια πάνω στο ίδιο ακριβώς δείγμα, γιατί η μέθοδος εξαγωγής, τα τεχνικά πρωτόκολλα και η βιοπληροφορική ανάλυση διαφέρουν από εργαστήριο σε εργαστήριο, και κάθε επιλογή αφήνει το δικό της αποτύπωμα πάνω στο τελικό νούμερο.

Πρόκειται για κάτι πολύ πιο συχνό απ' όσο φαντάζεσαι, ακόμα και ανάμεσα σε σοβαρά εργαστήρια με πιστοποιημένο προσωπικό. Η επιλογή μεθόδου εξαγωγής DNA από μόνη της μπορεί να αλλάξει τη φαινόμενη σύνθεση της μικροβιακής κοινότητας περισσότερο από πολλές πραγματικές βιολογικές διαφορές ανάμεσα σε δύο ανθρώπους.

ΜΕΛΕΤΗ Δοκιμάζοντας 21 διαφορετικά πρωτόκολλα εξαγωγής DNA πάνω στα ίδια δείγματα κοπράνων, οι ερευνητές βρήκαν ότι η επιλογή μεθόδου εξαγωγής μετατόπιζε τη φαινόμενη σύνθεση της μικροβιακής κοινότητας πιο έντονα από τη φυσική βιολογική διακύμανση μέσα στο ίδιο δείγμα. Costea et al., 2017, Towards standards for human fecal sample processing in metagenomic studies, Nature Biotechnology.

Το ίδιο δείγμα κοπράνων, λοιπόν, μπορεί νόμιμα να καταλήξει σε δύο διαφορετικές αναφορές, χωρίς κανένα από τα δύο εργαστήρια να έχει κάνει λάθος με την τεχνική έννοια. Απλώς μέτρησαν διαφορετικά πράγματα με διαφορετικό τρόπο. Εδώ ξεκινούν τα έξι κριτήρια που θα σε βοηθήσουν να καταλάβεις ποια αναφορά αξίζει την εμπιστοσύνη σου.

Το τεστ σου δίνει δεδομένα, όχι διάγνωση

Μια εξέταση μικροβιώματος σου δίνει έναν κατάλογο αριθμών. Τι σημαίνουν πραγματικά αυτοί οι αριθμοί για σένα εξαρτάται από το ιστορικό σου, τα συμπτώματά σου και την εμπειρία του ανθρώπου που θα τα διαβάσει δίπλα σου.

Δύο άνθρωποι με πανομοιότυπες τιμές στην αναφορά μπορεί να χρειάζονται εντελώς διαφορετική προσέγγιση, ανάλογα με το αν είχαν πρόσφατα αντιβίωση, ταξίδι, αλλαγή διατροφής ή χρόνιο στρες. Το νούμερο μένει το ίδιο, το πλαίσιο γύρω του αλλάζει τα πάντα.

Η ίδια πειθαρχία, να ξεχωρίζεις τι είναι θεωρητικός μηχανισμός και τι άμεσα μετρημένο εύρημα, καθορίζει την κλινική ερμηνεία και σε θέματα εντελώς μακριά από το μικροβίωμα, όπως στη σύνδεση ευερέθιστου εντέρου με τα ποσοστά επιτυχίας στην εξωσωματική. Ένα καλό ιστορικό λύνει αυτή τη διαφορά, ένας πίνακας τιμών μόνος του δεν μπορεί.

Ποια μέθοδος κρύβεται πίσω από τον αριθμό σου

Πίσω από κάθε αριθμό σε μια αναφορά μικροβιώματος κρύβεται μία από πέντε βασικές εργαστηριακές μεθόδους, και κάθε μία βλέπει το δείγμα σου από τελείως διαφορετική οπτική γωνία.

Τι σημαίνει αν η δική σου εξέταση δεν είναι καν από κόπρανα

Η δική σου αναφορά πιθανότατα βασίζεται σε μία από τις πέντε παραπάνω, συχνότερα στο 16S rRNA sequencing λόγω κόστους. Υπάρχει όμως και μια πιο θεμελιώδης ερώτηση που προηγείται όλων, από ποιο βιολογικό υλικό προέρχεται καν η εξέταση.

Πότε ένα τεστ λέει κάτι, και πότε απλά μυρίζει καπνό

Το IBSyncrasy δείχνει βήμα βήμα πώς να διαβάζεις σωστά τι μετράει πραγματικά κάθε εξέταση, πριν χτίσεις πάνω της οποιοδήποτε πρωτόκολλο. Αγόρασε το IBSyncrasy

Τα 6 κριτήρια ποιότητας ενός τεστ μικροβιώματος, με μια ματιά

Πριν μπεις στη λεπτομέρεια κάθε κριτηρίου, δες τα όλα μαζί σε μία ματιά. Το ίδιο ερώτημα, ποιο επίπεδο τεκμηρίωσης στηρίζει πραγματικά έναν ισχυρισμό, είναι αυτό που κρίνει πόσο εμπιστεύεσαι και μια αναφορά για υπερεπεξεργασμένα τρόφιμα και εγκέφαλο σε παιδιά, την ίδια λογική εφαρμόζεις και εδώ.

Η μέθοδος εξαγωγής DNA που κανείς δεν αναφέρει στην ετικέτα

Η εξαγωγή DNA είναι το πρώτο βήμα κάθε εξέτασης μικροβιώματος, και είναι επίσης το βήμα που αλλάζει περισσότερο το τελικό αποτέλεσμα χωρίς ο ασθενής να το μαθαίνει ποτέ. Πριν καν μπει το δείγμα στη μηχανή αλληλούχισης, το πόσο αποτελεσματικά σπάει το εργαστήριο τα κυτταρικά τοιχώματα κάθε είδους βακτηρίου καθορίζει ποιοι μικροοργανισμοί θα εμφανιστούν, και σε ποιο ποσοστό, στην τελική αναφορά.

Ορισμένα βακτήρια, ειδικά τα gram-θετικά με χοντρό κυτταρικό τοίχωμα, χρειάζονται πιο επιθετική μηχανική ή χημική λύση για να απελευθερώσουν το DNA τους. Ένα ήπιο πρωτόκολλο εξαγωγής τα υποεκτιμά συστηματικά, ακόμα κι όταν είναι πραγματικά άφθονα στο δείγμα σου.

Εξαγωγή DNA (extraction)

Το εργαστηριακό βήμα που σπάει τα κυτταρικά τοιχώματα των μικροοργανισμών μέσα στο δείγμα και απομονώνει το γενετικό τους υλικό, πριν αυτό αντιγραφεί ή αλληλουχηθεί.

Μια διεθνής σύγκριση πρωτοκόλλων έδειξε ακριβώς πόσο μεγάλη είναι αυτή η επίδραση, πολύ μεγαλύτερη από όσο υποψιάζονται οι περισσότεροι που διαβάζουν μια αναφορά μικροβιώματος για πρώτη φορά.

Τεχνικοί μάρτυρες, γιατί η απουσία τους είναι κόκκινη σημαία

Ένας τεχνικός μάρτυρας είναι ένα δείγμα γνωστής σύστασης που περνάει παράλληλα με το δικό σου μέσα από όλη τη διαδικασία, ώστε το εργαστήριο να αποδεικνύει ότι η μέθοδος δουλεύει σωστά εκείνη τη συγκεκριμένη ημέρα, με εκείνη τη συγκεκριμένη παρτίδα αντιδραστηρίων.

Ένας αρνητικός μάρτυρας επιτρέπει σε ένα εργαστήριο να ξεχωρίσει τι πραγματικά προήλθε από το δείγμα σου και τι μπήκε κατά λάθος από τα ίδια τα αντιδραστήρια εξαγωγής. Αυτό ακούγεται θεωρητικό, είναι όμως ένα από τα πιο τεκμηριωμένα προβλήματα στην επιστήμη του μικροβιώματος.

ΜΕΛΕΤΗ Τα kit εξαγωγής DNA και άλλα εργαστηριακά αντιδραστήρια περιέχουν σχεδόν πάντα δικό τους μικροβιακό DNA, και αυτή η μόλυνση επηρεάζει κρίσιμα τα αποτελέσματα σε δείγματα χαμηλής μικροβιακής βιομάζας. Salter et al., 2014, Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses, BMC Biology.

Οι ίδιοι ερευνητές συνιστούν ρητά ταυτόχρονη αλληλούχιση αρνητικών μαρτύρων σε κάθε παρτίδα, ακριβώς για να ξεχωρίζει η μόλυνση του αντιδραστηρίου από την πραγματική εικόνα του εντέρου σου. Ένα εργαστήριο που το κάνει αυτό συστηματικά σου το αναφέρει ανοιχτά, δεν χρειάζεται να το ρωτήσεις δύο φορές.

Επαναληψιμότητα, τι σημαίνει αν το ίδιο δείγμα σου έδινε διαφορετικό αποτέλεσμα

Επαναληψιμότητα σημαίνει ότι το ίδιο ακριβώς δείγμα, αναλυμένο δύο φορές στο ίδιο εργαστήριο, δίνει σχεδόν το ίδιο αποτέλεσμα και τις δύο φορές. Ακούγεται αυτονόητο, όμως στην πράξη είναι ένα από τα πιο δύσκολα σημεία να πετύχει ένα εργαστήριο μικροβιώματος με συνέπεια.

Μια μεγάλη διεθνής συνεργασία εργαστηρίων εξέτασε ακριβώς αυτό, στέλνοντας τυφλά δείγματα με επαναλήψεις σε δεκαπέντε διαφορετικά εργαστήρια, για να δει πόσο σταθερή μένει η ταξινομική εικόνα ενός δείγματος όταν αλλάζει μόνο το ποιος το επεξεργάζεται.

ΜΕΛΕΤΗ Δεκαπέντε εργαστήρια ανέλυσαν τυφλά δείγματα κοπράνων με τεχνικές επαναλήψεις, και η μεταβλητότητα εξαρτιόταν κυρίως από τον τύπο του βιολογικού δείγματος, μετά από τη μέθοδο εξαγωγής DNA και το περιβάλλον επεξεργασίας. Sinha et al., 2017, Assessment of variation in microbial community amplicon sequencing by the Microbiome Quality Control project consortium, Nature Biotechnology.

Ένα εργαστήριο που πιστεύει στην ποιότητά του δημοσιεύει ή σου δίνει, όταν το ζητήσεις, στοιχεία test-retest πάνω στο ίδιο δείγμα. Αυτά τα στοιχεία είναι ο πραγματικός τρόπος να ελέγξεις τη σταθερότητα του εργαστηρίου, πέρα από τη φήμη του.

Όρια ανίχνευσης, γιατί ένα καθαρό αποτέλεσμα μπορεί απλά να μην έψαξε αρκετά βαθιά

Κάθε μέθοδος ανίχνευσης έχει ένα κατώφλι κάτω από το οποίο ένας μικροοργανισμός θεωρείται απών, ακόμα κι αν στην πραγματικότητα υπάρχει σε πολύ μικρό αριθμό μέσα στο δείγμα σου. Το πόσο χαμηλό είναι αυτό το κατώφλι εξαρτάται άμεσα από το βάθος αλληλούχισης, δηλαδή πόσες φορές διάβασε η μηχανή το ίδιο κομμάτι DNA.

Ένα ρηχό, φθηνό πρωτόκολλο μπορεί νόμιμα να σου δείξει μηδενική παρουσία ενός παθογόνου που θα εμφανιζόταν καθαρά σε ένα βαθύτερο, ακριβότερο πρωτόκολλο πάνω στο ίδιο ακριβώς δείγμα. Μια αναφορά καθαρό αξίζει να τη διαβάζεις πάντα μαζί με το βάθος αλληλούχισης που χρησιμοποιήθηκε.

• ▲ Ζήτα να μάθεις το ελάχιστο ποσοστό ανίχνευσης που δηλώνει το εργαστήριο, όχι μόνο το τελικό αποτέλεσμα
• ▲ Ρώτα αν η μέθοδος έχει ξεχωριστό κατώφλι για σπάνιους παθογόνους μικροοργανισμούς
• ▲ Δώσε προσοχή όταν μια αναφορά δηλώνει μηδενική παρουσία για κάτι που το ιστορικό σου κάνει πιθανό

Τα ίδια ζητήματα χαμηλής βιομάζας που δυσκολεύουν τον έλεγχο μόλυνσης δυσκολεύουν και τον καθορισμό ρεαλιστικών ορίων ανίχνευσης, ειδικά όταν ψάχνεις κάτι σπάνιο μέσα σε ένα πυκνό μικροβιακό περιβάλλον σαν το έντερο.

Σχετική έναντι απόλυτης αφθονίας, το νούμερο που παρεξηγείται περισσότερο

Η σχετική αφθονία δείχνει τι ποσοστό του συνόλου των αναγνωσμένων αλληλουχιών ανήκει σε κάθε είδος, ένα μερίδιο μέσα στο δείγμα. Η απόλυτη αφθονία δείχνει τον πραγματικό αριθμό, συνήθως ανά γραμμάριο δείγματος, και χρειάζεται ξεχωριστή μέτρηση για να υπολογιστεί.

Η διαφορά φαίνεται μικρή στα χαρτιά, όμως αλλάζει εντελώς την ερμηνεία. Αν ένα ωφέλιμο βακτήριο εμφανίζεται χαμηλό σε ποσοστό, αυτό μπορεί να σημαίνει είτε ότι πραγματικά έχει λιγοστέψει, είτε ότι κάτι άλλο πολλαπλασιάστηκε δίπλα του και το ωφέλιμο βακτήριο έμεινε στον ίδιο απόλυτο αριθμό αλλά κατάλαβε μικρότερο μερίδιο της πίτας.

ΜΕΛΕΤΗ Συνδυάζοντας μέτρηση κυττάρων με κυτταρομετρία ροής και αλληλούχιση, οι ερευνητές έδειξαν ότι το συνολικό μικροβιακό φορτίο του δείγματος καθορίζει σε μεγάλο βαθμό ποιος τύπος κοινότητας εμφανίζεται στα σχετικά δεδομένα, κάτι που η καθαρή σχετική αφθονία δεν μπορεί να αποκαλύψει μόνη της. Vandeputte et al., 2017, Quantitative microbiome profiling links gut community variation to microbial load, Nature.

Στην πράξη, ζήτα να μάθεις αν η αναφορά σου δίνει ποσοστά ή πραγματικούς αριθμούς. Τα περισσότερα φθηνά consumer τεστ δίνουν μόνο ποσοστά, κάτι που δεν είναι λάθος από μόνο του, αρκεί να το ξέρεις πριν βγάλεις συμπεράσματα για το αν κάτι πραγματικά αυξήθηκε ή μειώθηκε.

Μετρημένες έναντι συναγόμενων λειτουργιών, πόσα από τα ευρήματα είναι στην πραγματικότητα πρόβλεψη λογισμικού

Πολλές αναφορές μικροβιώματος περιλαμβάνουν ένα κομμάτι λειτουργικού προφίλ, δηλαδή τι κάνει το μικροβίωμά σου, πέρα από το ποιος ζει εκεί. Το 16S rRNA sequencing, η πιο διαδεδομένη μέθοδος στα consumer τεστ, διαβάζει μόνο ένα κοινό κομμάτι του γονιδιώματος, ξένο προς τα γονίδια που κάνουν αυτές τις λειτουργίες.

Λογισμικό σαν το PICRUSt παίρνει το ποιος ζει εκεί από το 16S και το συγκρίνει με βάσεις δεδομένων γνωστών, πλήρως αλληλουχημένων γονιδιωμάτων, για να προβλέψει ποια γονίδια είναι πιθανό να υπάρχουν. Είναι μια στατιστική εκτίμηση, όχι μια μέτρηση.

ΜΕΛΕΤΗ Η καταγραφή φυλογενετικών δεικτών όπως το 16S rRNA δεν δίνει άμεση απόδειξη των λειτουργικών ικανοτήτων μιας μικροβιακής κοινότητας. Το εργαλείο PICRUSt προβλέπει τη λειτουργική σύνθεση από δεδομένα δείκτη γονιδίου και μια βάση αναφοράς γονιδιωμάτων. Langille et al., 2013, Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences, Nature Biotechnology.

Τα δεδομένα τα δίνει το εργαστήριο. Την απάντηση τη δίνει η εμπειρία που ξέρει τι να ρωτήσει πριν κοιτάξει το νούμερο.

Shotgun metagenomics διαβάζει το σύνολο του DNA του δείγματος και εντοπίζει απευθείας τα γονίδια, άρα το λειτουργικό της προφίλ είναι πραγματική μέτρηση. Είναι κι αυτός ένας λόγος που κοστίζει περισσότερο και παραμένει σπανιότερη επιλογή στα φθηνά consumer τεστ.

Το χαρτί δεν αντικαθιστά την εμπειρία που το διαβάζει

Μια εξέταση μικροβιώματος που περνάει και τα έξι κριτήρια παραμένει πολύτιμο, μένει όμως πάντα ένα κομμάτι δεδομένων μέσα σε μια μεγαλύτερη εικόνα. Ακόμα κι όταν η αλληλούχιση είναι άψογη, υπάρχουν επίπεδα ρύθμισης όπως η επιγενετική μεταβλητότητα φάσης που ζουν έξω από το ίδιο το DNA, και εκεί ακριβώς μπαίνει η εμπειρία του κλινικού που ξέρει τι να ρωτήσει πριν κοιτάξει το νούμερο.

Στην πράξη, οι πιο σοβαρές παρανοήσεις που βλέπω ξεκινούν συχνότερα από σωστά εργαστήρια των οποίων το αποτέλεσμα διαβάστηκε χωρίς πλήρες ιστορικό. Ένα σωστό τεστ σε άπειρα χέρια δίνει συχνά χειρότερη απόφαση από ένα μέτριο τεστ που το διαβάζει κάποιος με εμπειρία.

Χρησιμοποίησε τα έξι κριτήρια αυτού του άρθρου σαν πρώτο φίλτρο για κάθε τεστ μικροβιώματος που εξετάζεις, και μετά βρες κάποιον που θα σου ζητήσει το πλήρες ιστορικό σου πριν σου πει τι σημαίνει το χαρτί που κρατάς.